RŮST LESNÍCH STROMŮ VYPĚSTOVANÝCH IN VITRO Z ORGÁNOVÝCH KULTUR A ZE SOMATICKÝCH EMBRYÍ

Prof. Ing. Vladimír Chalupa, DrSc. - Lesnická fakulta ČZU v Praze

Reprodukce lesních stromů in vitro umožňuje rychlé rozmnožování elitních stromů a populací, které mají cenné genetické vlastnosti. Rozmnožování lesních dřevin in vitro hraje významnou úlohu při realizaci šlechtitelských programů a při záchraně genofondu ohrožených stromů a populací lesních dřevin.

CÍLE A VÝZNAM REPRODUKCE LESNÍCH STROMŮ METODAMI IN VITRO

Cílem množení in vitro je podstatné zlepšení genetických vlastností pěstovaných lesních porostů, rozmnožením produktivních a odolných genotypů. Komplex metod založený na kultivaci explantátů in vitro představuje nový netradiční progresivní systém moderních metod a postupů, které umožňují rychlé množení cenných genotypů. Tyto nové technologie umožňují produkovat v krátkém časovém období na relativně malém prostoru velké množství rostlin z explantátů, které byly odebrány z elitních stromů nebo z hybridů získaných kontrolovaným opylením, nebo z geneticky modifikovaných buněk a stromů. Moderní biotechnologie přinášejí převratný pokrok v oboru reprodukce lesních stromů a představují kvalitativně novou etapu při vytváření a rozmnožování genotypů se speciálními vlastnostmi. Lze očekávat, že s nástupem nového století se budou v lesním provozu stále významněji uplatňovat moderní biotechnologické metody, které byly objeveny a vypracovány v druhé polovině 20. století.

Při našich pracích, věnovaných reprodukci lesních stromů, jsme začali provádět experimenty s rozmnožováním lesních stromů metodami in vitro již v roce 1967 a v letech 1967-1973 jsme vybudovali ve VÚLHM Jíloviště-Strnady jednu z prvních evropských specializovaných biotechnologických laboratoří, zaměřenou na rozmnožování lesních stromů metodami in vitro (Chalupa - Lesnická práce 1974, č. 12 ). V této laboratoři jsme v letech 1967-1990 vypracovali originální metody pro rozmnožování in vitro významných evropských druhů lesních stromů (Chalupa 1974, 1979, 1983, 1985, 1987), které jsou nyní všeobecně používány pro jejich rozmnožování in vitro . Sazenice vypěstované in vitro jsme po otužení vysadili na venkovní plochy a v dalších letech jsme zjišťovali jejich vývin a růst. Vzhledem k dlouhověkosti lesních stromů je důležité získat poznatky o růstu stromů, produkovaných metodami in vitro . V tomto sdělení uvádíme některé naše výsledky o růstu stromů, které jsme vypěstovali in vitro a které byly vysazeny a rostou 15-25 let na různých stanovištích za odchylných klimatických podmínek.

RŮST LESNÍCH STROMŮ VYPĚSTOVANÝCH IN VITRO Z ORGÁNOVÝCH KULTUR

Rozmnožování lesních stromů in vitro je možné docílit při použití různých kategorií explantátových kultur, zejména při použití kalusových kultur, orgánových kultur a embryogenních kultur. Při rozmnožování listnatých druhů lesních dřevin jsme doposud dosáhli nejlepších výsledků při použití orgánových kultur (Chalupa 1979, 1983, 1984). Orgánové kultury pěstované in vitro lze pokládat za geneticky stabilní a u lesních dřevin množených tímto způsobem nedochází k chromozomovým změnám. Při pěstování orgánových kultur jsou kultivovány apikální meristémy jako vysoce stabilní struktury zaručující diploidní charakter reprodukce a genetickou stabilitu reprodukovaných stromů. Složení živných médií, na kterých jsme orgánové kultury pěstovali, jsme zvolili tak, aby bylo stimulováno vytváření a prodlužování axilárních pupenů. Slabé koncentrace růstových fytohormonů ze skupiny cytokininů (BAP) a auxinů (IBA) stimulovaly vytváření a růst axilárních a terminálních pupenů a umožnily rychlé množení explantátů.

U většiny našich hospodářsky významných listnatých druhů lesních stromů jsme dosáhli jejich rychlou mikropropagaci (u druhů rodu Quercus, Fagus, Populus, Betula, Tilia, Fraxinus, Ulmus, Acer, Sorbus, Alnus, Carpinus, Salix, Prunus, Robinia, Juglans). Koeficient množení je při použití této metody velký, během jednoho roku je možno z odebraného explantátu vypěstovat několik tisíc až několik milionů rostlin, které mají stejné genetické vlastnosti jako mateřská rostlina, ze které byl explantát odebrán. Nejsnadněji se množí a značných koeficientů množení lze dosáhnout při odebrání explantátů z juvenilních rostlin (semenáčků), nebo z juvenilních částí stromů. Zakořenění prýtů, odebraných z množících se kultur, jsme stimulovali na minerálně chudších médiích, při použití nízkých koncentrací auxinů (IBA, NAA). U většiny druhů bylo dosaženo vysoké procento zakořenění prýtů (60-95 %). Rovněž zakořeňování prýtů přímo v nesterilním substrátu, po jejich předchozím ošetření auxiny, poskytlo u mnoha druhů dřevin dobré výsledky a vysoké procento zakořenění. Po aklimatizaci na venkovní podmínky a po otužení byly rostliny vypěstované in vitro vysazeny jako obalené sazenice na venkovní plochy, kde byl jejich růst porovnáván s růstem sazenic vypěstovaných ze semen.

Sazenice vypěstované in vitro pokračovaly po výsadbě na venkovních plochách v růstu a jejich úmrtnost nebyla vyšší, než u sazenic vypěstovaných ze semen. Ztráty po vysazení na venkovní plochy byly v prvním zimním období nízké a ani v následujících letech nedošlo k větším ztrátám v zimním ani ve vegetačním období a ztráty nebyly větší než u sazenic vypěstovaných ze semen. Výškový a tloušťkový růst stromů vypěstovaných in vitro probíhal podobně jako u stromků vypěstovaných ze semen. Po víceletém růstu dosáhly stromy vypěstované in vitro značných rozměrů (graf 1). Nebyly pozorovány žádné významné odchylky ve výškovém a tloušťkovém růstu, ani v morfologii a habitu stromů vypěstovaných in vitro ve srovnání se stromy vypěstovanými ze semen. Při cytologickém šetření byl zjištěn u stromů množených in vitro normální, diploidní počet chromozomů. Ve stáří 18 let dosáhly stromy vypěstované in vitro značných rozměrů (graf 1), a některé druhy kvetly a vytvářela se u nich klíčivá semena, podobně jako u stromů vypěstovaných ze semen. Stromy pocházející z téhož mateřského jedince vykazovaly uniformitu v morfologických znacích a ve fenologických projevech.

Rovněž u různých druhů konifer (Picea abies, Pinus sylvetris, Larix decidua, Pseudotsuga menziesii) jsme dosáhli jejich rozmnožování in vitro a stromky vypěstované in vitro byly vysazeny na venkovní plochy (Chalupa 1983, 1993). Rozmnožování konifer pomocí orgánových kultur je obtížnější než u listnatých stromů zejména z důvodů jejich odchylné morfologické stavby (malého počtu axilárních pupenů). Rozmnožování juvenilních rostlin konifer jsme dosáhli jednak stimulací růstu axilárních pupenů, jednak indukcí adventivních pupenů na kotyledonech, mladých jehlicích a izolovaných pupenech, které byly pěstovány na živných médiích obsahujících cytokinin (BAP). Vývin indukovaných pupenů v delší prýty byl stimulován na médiích neobsahujících fytohormony. Prýty vypěstované v aseptických kulturách byly zakořeněny v živném médiu po předchozí stimulaci auxiny, poté přesazeny do nesterilního substrátu a po otužení vysazeny na venkovní plochy. Výškový a tloušťkový růst stromků vypěstovaných in vitro probíhal normálně a byl srovnatelný s růstem stromků vypěstovaných ze semen. Stromky vypěstované in vitro měly normální tvar a nebyly pozorovány abnormality ve struktuře, velikosti a morfologii jehlic, větví a koruny. Růst a vývin sazenic vypěstovaných in vitro byl v některých případech ovlivněn v počátečních obdobích po vysazení počtem vytvořených kořenů a dalším vývinem kořenového systému, v pozdějších letech se většinou již tyto vlivy výrazněji neprojevovaly.

RŮST LESNÍCH STROMŮ VYPĚSTOVANÝCH IN VITRO ZE SOMATICKÝCH EMBRYÍ

Velmi významnou metodou pro rychlé množení in vitro konifer a listnatých stromů je somatická embryogeneze, při které dochází k vytváření rostlin ze somatických embryí (Chalupa 1974, 1985, 1987, 1991). Pomocí somatické embryogeneze je možno během krátkého časového období produkovat velká množství identických rostlin z malých explantátů.

V počátečních fázích embryogeneze se embryogenní buňky pěstované na živných médiích dělí a vytváří bipolární somatická embrya s diferencovanými vzrůstovými vrcholy a základy kořínků. Celý proces somatické embryogeneze, který probíhá na živných médiích v laboratorních podmínkách, se značně podobá procesu vytváření zygotických embryí v semenech na stromech, zejména u konifer. Somatická embrya, vytvářející se v embryogenních kulturách pěstovaných na živných médiích v laboratorních podmínkách, procházejí podobnými fázemi vývoje, jako zygotická embrya vytvářející se v semenech na stromech. Založení embryogenních kultur je značně ovlivněno vývojovým stadiem použitého explantátu. Nejlepších výsledků je dosahováno při použití juvenilních explantátů (nezralá nebo zralá zygotická embrya), založení embryogenních kultur z explantátů odebraných z vývojově starších částí rostliny je prozatím většinou obtížné.

Při našich experimentech jsme dosáhli vytváření somatických embryí jak u našich hlavních druhů konifer (Picea abies, Larix decidua, Abies alba, Pinus sylvestris), tak u některých druhů listnatých lesních stromů (Chalupa 1985, 1987, 1991). U somatických embryí, vypěstovaných z embryogenních kultur, bylo na živných médiích stimulováno jejich klíčení a další vývin v kompletní rostliny s vegetačním vrcholem a kořeny. Po přesazení těchto somatických semenáčků do substrátu a po jejich aklimatizaci, byly somatické sazenice konifer a listnatých stromů vysazeny na venkovní plochy. Jejich další růst probíhal podobně jako růst sazenic ze semen. Zimní období přežily somatické sazenice bez větších ztrát, a to i když v zimě teploty poklesly hluboko pod bod mrazu. Celkové ztráty somatických sazenic během roku nepřesahovaly ztráty sazenic vypěstovaných ze semen. Výškový a tloušťkový růst stromků Picea abies, Larix decidua a dalších druhů vypěstovaných ze somatických embryí probíhal normálně a byl srovnatelný s růstem stromků vypěstovaných ze semen. Stromy vypěstované ze somatických embryí měly ortotropní růst a nebyly pozorovány morfologické abnormality a diference ve tvaru a struktuře jehlic, větví a koruny ve srovnání se stromy vypěstovanými ze semen. Ve stáří 12 let dosáhly stromy Picea abies a Larix decidua vypěstované in vitro ze somatických embryí podobných rozměrů, jako stromy vypěstované ze semen (graf 2).

VYUŽITÍ VÝSLEDKŮ EXPERIMENTÁLNÍCH PRACÍ

V současné době v biotechnologické laboratoři na Lesnické fakultě ČZU v Praze pracujeme na dalším zdokonalení rozmnožování lesních stromů metodami in vitro , zejména pomocí somatické embryogeneze. S novými moderními technologiemi rozmnožování lesních stromů jsou seznamováni studenti Lesnické fakulty ČZU, z nichž někteří již vypracovali nebo pracují na diplomových pracích věnovaných této problematice. Vědecké práce v tomto oboru jsou aktivně podporovány vedením Lesnické fakulty ČZU. Finančně jsou naše práce podporovány zejména Grantovou agenturou ČR, která rovněž financuje dlouhodobý komplexní projekt zaměřený na další zdokonalení metod rozmnožování lesních stromů in vitro , který je řešen od roku 1996 Lesnickou fakultou ČZU ve spolupráci s VÚLHM Jíloviště-Strnady, MZLU v Brně, Přírodovědeckou fakultou UK v Praze a Ústavem experimentální botaniky AV ČR v Praze. Výsledky našich experimentů by měly nalézt praktické uplatnění v lesním hospodářství prostřednictvím provozních laboratoří explantátových kultur. V roce 1989 jsme ve VÚLHM vypracovali a předložili ministerstvu návrh na vybudování provozní laboratoře explantátových kultur ve školkařském středisku Olešná u Jihočeských státních lesů s cílovou kapacitou 500 000 sazenic produkovaných in vitro . I když se uvedení do provozu této laboratoře opozdilo, jsou nyní v této Laboratoři biotechnologií Olešná úspěšně produkovány kvalitní sazenice různých druhů listnatých stromů in vitro pomocí orgánových kultur a je třeba provoz této laboratoře podporovat a rozšiřovat.

V současné době je v evropských a zámořských zemích každoročně produkováno celkem několik milionů sazenic lesních dřevin in vitro pro provozní účely a jejich produkce má stoupající trend. V Evropě jsou in vitro množeny zejména listnaté druhy dřevin pomocí orgánových kultur (topoly, osiky, břízy, třešně, eukalypty a další). V USA, v Kanadě, na Novém Zélandu a v Austrálii jsou množeny in vitro některé jehličnaté dřeviny (zejména některé druhy smrků a borovic) pomocí somatické embryogeneze. Je předpokládáno, že po dalším zdokonalení a propracování metod somatické embryogeneze bude těmito technologiemi produkováno ročně několik desítek milionů sazenic vysoké genetické hodnoty.

LITERATURA

Chalupa V., 1974: Možnosti použití tkáňových kultur pro zvýšení dřevní produkce lesních porostů. - Lesnická práce 53: 542-546.

Chalupa V., 1979: In vitro propagation of some broad - leaved forest trees.-Commun. Inst. Forest. Čechosl. 11: 59-70.

Chalupa V., 1983: Micropropagation of conifer and broadleaved forest trees.-Commun. Inst. Forest. Čechosl. 13: 7-39.

Chalupa V., 1984: Vegetativní množení dubu (Quercus robur L.), lípy (Tilia cordata Mill. ) a jeřábu (Sorbus aucuparia L.) in vitro . - Lesnictví 30: 1019-1028.

Chalupa V., 1985: Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured immature and mature embryos of Picea abies /L./ Karst. - Commun. Inst. Forest. Čechosl. 14: 57-63.

Chalupa V., 1985: Rozmnožování osiky (Populus tremula L.) a topolů (Populus nigra L., P. alba L., P. euramericana /Dode/ Guin.) in vitro a růst stromů vzniklých in vitro . - Lesnictví 31: 785-802.

Chalupa V., 1987: Somatic embryogenesis and plant renegeration in Picea, Quercus, Betula, Tilia, Robinia, Fagus and Aesculus. - Commun. Inst. Forest. Čechosl. 15: 133-148.

Chalupa V., 1988: Rozmnožování lípy (Tilia cordata Mill.), akátu (Robinia pseudoacacia L.) a jeřábu (Sorbus aucuparia L.) in vitro a růst stromů vypěstovaných in vitro . - Lesnictví 34: 705-720.

Chalupa V., 1991: Somatická embryogeneze a regenerace rostlin u smrku (Picea abies /L./ Karst.) a u lípy (Tilia cordata Mill.). - Lesnictví 37: 1025-1033

Chalupa V., 1993: Rozmnožování modřínu (Larix decidua Mill.) orgánovými kulturami a růst stromů vypěstovaných in vitro . - Lesnictví - Forestry 39: 481-486