VYUŽITÍ ISOENZYMOVÝCH ANALÝZ V LESNICTVÍ
Ondřej Ivanek - VÚLHM Jíloviště-Strnady, Tato e-mailová adresa je chráněna před spamboty. Pro její zobrazení musíte mít povolen Javascript.
Isoenzymy řadíme, podobně jako např. DNA, do skupiny tzv. molekulárních genetických markerů. Jedná se o genetické znaky na molekulární úrovni, které lze na rozdíl od běžných, vizuálních morfologických znaků identifikovat v různých vývojových a věkových stadiích organismu - zde lesních dřevin - a v jeho různých částech, tj. v pupenech, listech, semenech, atd. Isoenzymy jsou tedy různé molekulární formy enzymů, jejichž syntéza v buňce je geneticky kódována strukturou DNA. Výskyt a poměrné zastoupení isoenzymů může být podobně jako jiné genetické znaky selektován vlivem prostředí, avšak přímý vliv tohoto prostředí je v tomto směru minimální.
PROBLEMATIKA ISOENZYMŮ
Analýza isoenzymů představuje v obecnějším metodickém rámci: 1) výběr populací nebo souborů sledovaných dřevin, 2) odběr vzorků, 3) vlastní biochemickou analýzu a 4) vyhodnocení dosažených výsledků s využitím statistických metod a postupů populační genetiky. V tomto pojetí, v jakém je také prováděna v isoenzymové laboratoři útvaru biologie a šlechtění VÚLHM, představuje velmi efektivní způsob genetického monitoringu. Vlastní analýza je založena na extrakci, rozdělení a zviditelnění směsi enzymů. Po technické stránce tedy zahrnuje jejich extrakci z vybraných rostlinných částí, přenesení získaného extraktu na vhodný nosič - polymerní gel, jejich rozdělení pomocí elektroforézy a konečně zviditelnění enzymů pomocí speciálních barviv, tj. způsobem, který je obdobou fotografického procesu. Takto vzniklé diagramy, které nesou informaci o zastoupení jednotlivých isoenzymů, zkráceně zymogramy jsou archivovány jako základ dalšího zpracování a vyhodnocení. Základem vyhodnocení výsledků isoenzymových analýz je jejich vyjádření poměrným (např. procentickým) zastoupením tzv. alel, které představují zastoupení různých variant genů, kódujících tvorbu jednotlivých isoenzymů.
V období let 1998-2000 bylo ve spolupráci s LČR, KRNAP a MŽP odebráno a isoenzymovou laboratoří VÚLHM zpracováno a analyzováno:
- 34 populací smrku ztepilého, které představují přibližně 1600 jedinců z celkem 8 PLO ČR a 26 lokalit (tab. Ia, b, c),
- 6 populací borovice horské (celkem 171 jedinců) ze 2 PLO, 2 populace borovice lesní (116 jedinců) (tab. II),
- 4 soubory lípy velkolisté a lípy srdčité ze 4 lokalit (celkem 65 jedinců) a 6 souborů jilmu horského, jilmu vazu a jilmu habrolistého ze 4 lokalit (celkem 90 jedinců z různých PLO ČR).
MONITOROVÁNÍ POROSTŮ SMRKU ZTEPILÉHO V KRUŠNÝCH HORÁCH
Oblast Krušných hor patřila v nedávné minulosti k evropským oblastem nejvíce postiženým průmyslovými imisemi elektrárenského a jiného původu. Tyto imise byly ve střední Evropě významně sníženy v 90. letech, avšak přesto jsou stále významným faktorem. Nadále se podílejí na úhynu jehličnatých lesů, zejména v kombinaci s extrémními klimatickými výkyvy, jež jsou v současné době poměrně časté. Smrk ztepilý je jako naše nejrozšířenější dřevina středem zájmu. Existuje řada údajů dokumentujících možné vztahy mezi citlivostí populací lesních dřevin vůči znečištění atmosféry a jejich genetickou strukturou, sledovanou pomocí analýzy isoenzymů (Mejnartowicz 1983, Scholz a Bergman 1984, Geburek et al. 1987, Prus-Glowacki a Godzik 1995).
Materiál a metody
V r. 1999 byl ve spolupráci s OI LČR v Teplicích proveden rozsáhlý genetický monitoring smrku ztepilého ve střední části Krušných hor pomocí isoenzymových analýz. Tento výzkum navázal na první, orientační srovnání vybraných populací smrku z Krušných hor a Krkonoš (Ivanek 1998). Byly vybrány a sledovány stromy s různou tolerancí vůči nejvýznamnějším stresovým faktorům. Tato tolerance byla určena v terénu na základě různého imisního a mrazového poškození ze zimy r. 1995/96, přičemž byly vybrány stromy v nejlepším zdravotním stavu (zařazené do skupiny “tolerantní” - T) a s největším poškozením (zařazené do skupiny “senzitivní” - S). Byly odebrány dormantní pupeny smrku z celkem 498 jedinců ze 3 revírů: Načetín, Kalek a Nový dům. V každém revíru proběhl výběr vždy po 2 skupinách, tj. se zastoupením senzitivních i tolerantních jedinců, celkem tedy ze 6 populací, v rozmezí nadmořské výšky souborů 660-830 m n. m. K odběrům byly vždy vybrány skupiny dvojic senzitivních a tolerantních jedinců v rámci stejného LVS (tab. III) v bezprostředním sousedství (ve vzájemné vzdálenosti do 50 m), aby byl eliminován možný vliv různých stanovištních podmínek.
Vzorky byly skladovány při teplotě -20 °C a pak podrobeny extrakci enzymů homogenizací 5-10 mg rostlinné tkáně s 40-60 ml extrakčního pufru. Isoenzymy byly děleny jednorozměrnou elektroforézou na škrobovém gelu při 3 °C s použitím horizontálního Tris-citrátového pufračního systému. Byla analyzována variabilita lokusů těchto enzymů: aspartátaminotransferáza, syn. glutamátoxaloacetáttransferáza (AAT syn. GOT), glutamátdehydrogenáza (GDH), glukózo-6-fosfátdehydrogenáza (G-6-PDH) a šikimátdehydrogenáza (SDH), s pomocí modifikovaných postupů isoenzymové extrakce, elektroforézy a barvicích postupů podle Pasteura a kol. (1988).
Výsledky a diskuse
U enzymatických systémů GDH, G-6-PDH a SDH byly pomocí -kvadrát testu zjištěny statisticky významné rozdíly v zastoupení jednotlivých isoenzymů mezi tolerantními a senzitivními jedinci u smrku. U souborů vyznačujících se zvýšenou senzitivitou vůči stresovým faktorům a projevujících se tedy největším zdravotním poškozením bylo přitom zjištěno toto: Zastoupení vzácněji se vyskytujících genetických variant (alel), bylo u enzymu G-6-PDH a ve většině případů i u enzymu SDH ještě dále sníženo u souborů senzitivních jedinců. U enzymu GDH tomu bylo obráceně (viz též Ivanek 2000). V tab. III jsou vzácněji se vyskytující alely označeny jako minoritní složky, definované zde výskytem < 20 % (hodnota 20 % byla zvolena proto, že zastoupení těchto složek obvykle nepřekračuje tuto hodnotu). U systému AAT není pojem minoritní složky použitelný vzhledem k přibližně stejnému relativnímu zastoupení alel.
Snížení výskytu vzácněji se vyskytujících alel bylo spojeno i se snížením genetické diverzity populací či porostů. V tab. III je dále uvedena heterozygotnost souborů smrku ztepilého pro jednotlivé enzymy. Největší rozdíly genetických charakteristik byly u enzymatického systému GDH zjištěny v revíru Kalek, u enzymu SDH v revíru Nový dům a u G-6-PDH pro úhrn všech revírů. Rozbor výsledků isoenzymových analýz v závislosti na LVS nebyl v tomto kontextu vyhodnocován.
ZÁVĚR
Dosažené výsledky a jejich statistický rozbor ukázaly, že mezi soubory smrku ztepilého, které se odlišovaly různým stupněm zdravotního poškození tolerantních jedinců lze nalézt průkazné genetické rozdíly, identifikovatelné pomocí analýzy isoenzymů - v tomto případě pro tři ze čtyř sledovaných enzymatických systémů. Přitom je stanovení genetických charakteristik populací možné v libovolném stadiu vývoje dřeviny a naznačuje možnost vytypování jedinců souborů smrku s genetickými předpoklady tolerance vůči stresovým faktorům životního prostředí v zájmové oblasti. Uplatnění dosažených výsledků v prakticky orientovaném šlechtění, zahrnující případnou selekci a namnožení takto vytypovaných stromů představuje přirozeně složitější problém, což poukazuje na nutnost dalšího sledování smrkových porostů v oblasti Krušných hor z tohoto hlediska.
Tab. 1a: Sledování smrku ztepilého pomocí isoenzymových analýz z přirozeně se vyskytujících porostů (1998-2000)
| PLO | Počet lokalit | Počet populací | Počet jedinců |
| Krušné hory | 5 | 8 | 390 |
| Krkonoše | 7 | 8 | 370 |
| Jizerské hory | 1 | 2 | 100 |
| Moravskoslezské Beskydy | 1 | 2 | 140 |
| Šumava | 1 | 3 | 90 |
| Středočeská pahorkatina | 3 | 4 | 135 |
| Českomoravská vrchovina | 2 | 2 | 75 |
| Nízký Jeseník | 1 | 1 | 45 |
Tab. 1b: Sledování smrku ztepilého pomocí isoenzymových analýz z klonových archivů (1998-99)
| PLO zastoupená v klon. archivu | Počet lokalit | Počet populací | Počet jedinců |
| Krušné hory | 1 | 1 | 100 |
| Středočeská pahorkatina | 3 | 3 | 160 |
Tab. 1c: Lokality odběru smrku ztepilého v rámci PLO ČR
| Krušné hory: Načetín, Kalek, Nový dům, GZ Jáchymov, Klínovec, Litvínov - klon. archiv Baně, Praha-Západ, |
| Krkonoše: Hřebenové partie, Údolí Velké Mumlavy, Příchovice, Černá hora, Labský důl, Sněžka, Pod Voseckou, |
| Jizerské hory: oblast Jizery, |
| Moravskoslezské Beskydy: oblast Smrku, |
| Šumava: Boubín, Pancíř, |
| Středočeská pahorkatina: Milevsko, Vlašim-Louňovice, Hluboká, Kostelec, Kácov, Konopiště - klon. archiv Kostelec n. Č. lesy, |
| Českomoravská vrchovina: Pelhřimov-Černovice, Polička-Proseč |
| Nízký Jeseník: Vítkov-Jánské Koupele |
Tab. II: Sledování borovice horské a borovice lesní pomocí isoenzymových analýz z přirozeně se vyskytujících porostů přírodních lesních oblastí a z klonových archivů (1999-2000)
| Odběr | Dřevina | Počet populací | Počet jedinců |
| Jizerské hory | borovice horská | 3 | 81 |
| Krkonoše | borovice horská | 3 | 90 |
| Klon. archiv VÚLHM-VS |
|
|
|
| Uh. Hradiště | borovice lesní | 2 | 116 |
Tab. III: Vybrané genetické charakteristiky tolerantních a senzitivních populací smrku ztepilého vybraných enzymatických systémů - Krušné hory
| Revír | 01 Načetín | 02 Kalek | 07 Nový dům | |||
| % zastoupení v: |
|
|
| |||
| 6. LVS |
| 89,5 | 12 | |||
| 7. LVS | 100 | 10,5 | 46 | |||
| 8. LVS |
|
| 42 | |||
| Populace jedinců T-tolerantních S-senzitivních | T | S | T | S | T | S |
| Celkové % zastoupení minoritních složek, tj. alel s výskytem pod 20 % | ||||||
| GDH | 0,9 | 1,9 | 0 | 8 | 1,2 | 1,2 |
| G-6-PDH | 7,8 | 1,9 | 15,6 | 3,8 | 11 | 7,1 |
| SDH | 9,2 | 11,5 | 16,7 | 4 | 13,4 | 1,5 |
| Heterozygotnost (%) | ||||||
| AAT | 50 | 62 | 53,3 | 30,8 | 62 | 52 |
| GDH | 1,9 | 3,8 | 0 | 23,1 | 6 | 6 |
| G-6-PDH | 11,8 | 3,8 | 31,3 | 7,7 | 22 | 16,3 |
| SDH | 18,5 | 23,1 | 33,3 | 7,7 | 16 | 2,9 |