Biotechnologie v lesním hospodářství a šlechtění

Cílem současného lesnictví není proto obnova původní druhové skladby lesa, ale zachování „přírodě blízkých“ lesních biotopů, jejichž dřevinná skladba by měla odpovídat stanovištním poměrům, a udržení nebo umělá obnova stávajících lesů v současné kulturní krajině (včetně vytváření nových lesních celků v městské zástavbě a v průmyslově devastovaných zónách). Je jisté, že pro obnovu lesa a speciální výsadby bude nezbytné zabezpečit dostačující množství kvalitního sadebního materiálu, k čemuž může přispět také šlechtění. Současně je však pro šlechtění lesních dřevin prvořadým úkolem zajistit i produkční a rezistentní odrůdy, které budou splňovat požadavky stoupající spotřeby dřeva.

Biotechnologie v reprodukci a šlechtění lesních dřevin

Vedle tradičních postupů generativní reprodukce výsadbového materiálu lze kvalitní sadební materiál získávat rovněž mikropropagačními technologiemi (in vitro – „ve skle“). Mikropropagace představuje soubor technik in vitro, jejíž cílem je rychlé namnožení (naklonování) rostlinného materiálu. V mnoha případech je to jediný možný způsob, jak zachránit silně ohrožené druhy nebo realizovat novošlechtění vysokoprodukčních nebo odolných odrůd.

Proto, aby byla nedůvěra k biotechnologiím obecně překonána, je třeba si uvědomit, že lidé odedávna křížili a selektovali co do užitnosti výhodné odrůdy rostlin (a rasy zvířat), tedy používali biotechnologické postupy. Ty však dovolovaly využít pouze vertikálního přenosu genetické informace (z rodičů na potomky). Nedávné potvrzení horizontálního přenosu genetické informace (mezidruhové výměny genů) a současný rozvoj genetiky a mikrobio-logie otevřely cestu k rozvoji genového inženýrství využívajícího genových manipulací, což umožňuje vyhnout se desítky let trvajícímu křížení a selektování nevhodných variant a téměř bezprostředně získat stabilní odrůdy vykazující požadované vlastnosti.

Přenos genů kódujících žádané vlastnosti je v současné době ve stále rostoucí míře využíván pro tvorbu vysokoprodukčních a rezistent-ních odrůd u řady zemědělských plodin. U dřevin je však vypracování spolehlivých regeneračních metodik časově náročnější a doposud není k dispozici metodika transformace, která by byla použitelná pro širší druhové spektrum dřevin. Nejčastěji užívané postupy nepřímého přenosu genů prostřednictvím bakterií rodu Agrobacterium jsou úspěšné jen tehdy, patří-li daný rostlinný druh mezi jejich hostitele. Především rod Populus se pro svoji citlivost k infekci bakteriemi z rodu Agrobac-terium stal oblíbeným modelem pro genetické inženýrství.

Kultivace rostlin in vitro

Rostlinné somatické buňky jsou na rozdíl od živočišných buněk totipotentní, což znamená, že buňky obsahují kompletní genetickou informaci daného organismu, takže je možné ve vhodných podmínkách indukovat morfogenetické procesy i u terminálně diferencovaných buněk a regenerovat tak plnohodnotně vyvinuté a životaschopné rostliny. Teoretické předpoklady pro rozvoj in vitro kultivačních technologií byly dány pracemi M. J. Schleidena (1838), T. Schwana (1839) (buněčná teorie) a Ch. Darwina (1880) (hormonální regulace rostlinného růstu). Náhodná pozorování tvorby kalusu a adventivních pupenů v místech poranění rostlinného pletiva vedly k experimentál-nímu ověřování možností kultivace izolovaných částí rostlin, které prováděli C. Rechinger (1893) a G. Haberlandt (1902). Koncepční a systematický výzkum však začal až po objevu růstových látek. Za skutečný začátek vědecky podložené kultivace rostlinných pletiv a buněk v in vitro podmínkách lze považovat rok 1939, kdy publikovali téměř současně výsledky svých pokusů P. White v USA (indukce růstu kořenů u kalusu tabáku) a R. Gautheret a P. Nobécourt ve Francii (indukce růstu kořenů u kalusu mrkve). Zavedení moderních mikropropagačních technologií umožnil objev P. White (1934), prokazující nepřítomnost virových částic v buňkách meristému nově se tvořících kořenech v kulturách in vitro, což G. Morelovi umožnilo využití těchto kultur nejen pro eliminaci viru (1952), ale později pro zavedení mikropropagačních kultur (1960). Přispěly k tomu rovněž objev rostlinných hormonů a poznání F. Skooga a C. O. Millera (1957), že různými kombinacemi auxinů a cytokininů lze modulovat regenerační potenciál in vitro kultivovaných rostlinných buněk a pletiv. V r. 1958

J. Reinert v Německu a F. Steward v USA popsali tvorbu somatických embryí z kalusů v buněčných suspenzních kulturách mrkve. Definitivní důkaz, že rostliny lze regenerovat somatickou embryogenezí nebo organogenezí z  pletivových nebo buněčných kultur, přinesly až práce I. K. Vasila a A. C. Hildebrandta (1965), kterým se podařilo z jednotlivých izolovaných buněk vypěstovat kompletní rostliny tabáku. Technologie in vitro mikropropagace zůstaly zpočátku omezeny na dvouděložné rostliny (luštěniny). Jednoděložné druhy a lesní dřeviny se v širším rozsahu podařilo takto propagovat až v osmdesátých letech 20. století, i když už předtím byly studovány možnosti kultivace in vitro u několika druhů borovic (A. Schmidt, 1924, R. Gautheret, 1934) a sekvoje vždyzelené (E. Ball, 1950).

Problematiku mikropropagace a její využití v lesním hospodářství zavedl u nás (ve Výzkumném ústavu lesního hospodářství a myslivosti) V. Chalupa počátkem sedmdesátých let 20. století, když vypracoval a uveřejnil postupy organogeneze a somatické embryogeneze pro řadu našich jehličnatých a většinu listnatých lesních dřevin.

Mikropropagační technologie

Explantátové kultury

Jako explantáty se obecně označují různé části rostlin, které jsou sterilně pěstovány v in vitro podmínkách na definovaných živných mediích. Výchozím materiálem pro explantáty jsou menší části rostlin (propagula), mohou to být prakticky všechny rostlinné části jako samčí i samičí gametofytická pletiva, generativní pletiva, nucelus a synergidní buňky, ale také pletiva, orgány, buňky, protoplasty a kalusy, které se při klasickém vegetativním způsobu množení nepoužívají. U lesních dřevin se jako zdrojové rostlinné části obvykle používají zralá i nezralá embrya, hypokotyly, kotyledony, vrcholky výrůstků (rašící semenáčky), apikální meristémy (apikální i axilární pupeny), celé výhony a orgány, jehličí nebo svazky jehličí (brachyblasty) a listy, ale také kambiální pletiva ze starších výhonů a dokonce jednotlivé buňky nebo protoplasty.

Úspěšnost mikropropagace určují kvalita zdrojového materiálu (volba vhodného dárce, jeho stáří a zdravotní stav, doba odběru), manipulace s rostlinným materiálem pro přípravu explantátů (způsob a délka skladování, účinnost sterilizace vůči patogenům a její šetrnost k pletivům explantátu), výběr kultivačních postupů in vitro a stanovení podmínek pro aklimatizaci dopěstovaných kompletních rostlin podle odlišných růstových požadavků jednotlivých druhů (chemické složení živného média, teplota, délka a intenzita osvitu).

Organogeneze

Prozatím nejúspěšnější metodou mikropropagace, zejména u listnatých dřevin, je organogeneze. Je vhodná pro klonové množení vyselektovaných dílčích populací stromů (při nedostatečné fruktifikaci nebo zničení semena hmyzem).

Při indukci organogeneze jsou hormonálně nastartovány morfogenetické pochody podmiňující diferenciaci pletiv v primárním explantátu. V jejich průběhu se vytvářejí výhony, které se použijí k další multiplikaci nebo k indukci zakořeňování. Po vytvoření kořenového systému a aklimatizaci se kompletní rostliny určené pro výsadbu vysazují na venkovní záhony k dopěstování. Ostatní materiál lze nadále uchovávat v genové bance explantátů pro další namnožení.

Organogeneze se osvědčila zejména u listnatých dřevin. V praxi byly úspěšně mikropropagovány zejména břízy (Betula sp.), třešeň ptačí (Prunus avium), eukalypty (Eucalyptus sp.), ořešáky (Juglans sp.), topoly (Populus sp.) a jabloně (Malus sp.). U jehličnanů se organogeneze využívá u zeravů (Thuya sp.), borovic (Pinus sp.), sekvojí (Sequoia sp.), u smrku ztepilého (Picea abies), douglasky tisolisté (Pseudotsuga menziesii), modřínu opadavého (Larix decidua) a tisu obecného (Taxus baccata).

Somatická embryogeneze

Při somatické embryogenezi (asexuální nebo adventivní embryogeneze) se vlivem hormonů vytvářejí ze somatických buněk primárního explantátu bipolární embrya s diferencovanými vzrůstovými vrcholy a základy kořenů. Primárním explantátem může být také zygotické embryo, z jehož haploidních i diploidních somatických buněk, nebo nepřímo z nediferencovaných buněk embryogenního pletiva (a také z buněčných suspenzí anebo protoplastových kultur) se při vhodné kultivaci vytvářejí somatická embrya, která se svými biochemickými a morfologic-kými vlastnostmi neodlišují od embryí vzniklých zygoticky.

Somatická embryogeneze se u listnatých dřevin prokázala jako výhodná mikropropagační technologie. Ze zygotických embryonálních explantátů nebo endospermu se podařilo indukovat somatická embrya, která úspěšně konvertovala na kompletní rostliny u ořešáku (Juglans regia), jírovce maďala a jírovce pleťového (Aesculus hippocastanum a A.x carnea), lísek (Corylus sp.), dubů (Quercus sp.), lípy malolisté a lípy velkolisté (Tilia cordata a T. platyphyllos), břízy bělokoré (Betula pendula) a olivovníku evropského (Olea europea). U jehličnanů byla tato metoda popsána u smrku ztepilého (Picea abies), smrku sivého (Picea glauca), několika druhů borovic (Pinus sp.), douglasky tisolisté (Pseudotsuga menziesii), modřínu opadavého (Larix decidua) a sekvoje vždyzelené (Sequoia sempervirens). Somatická embryogeneze se pro mikropropagaci jehličnanů ukazuje jako velmi perspektivní, i když se ne vždy daří získat životaschopný sadební materiál.

Klonový archiv explantátů

Ve Výzkumného ústavu lesního hospodářství a myslivosti, v.v.i, na pracovišti biologie a šlechtění lesních dřevin byly již standardizovány postupy mikropropagace pro řadu listnatých i jehličnatých dřevin. Mikropropagované klony lesních dřevin jsou uchovávány ve formě vícevrcholových kultur nebo embryogenních linií za definovaných podmínek v „Klonovém archivu in vitro“.

Klonový archiv slouží k uchovávání genových zdrojů lesních dřevin a k namnožení požadovaných klonů pro speciální výsadby. Zdrojový materiál pro mikropropagaci splňuje požadavky na genetickou klasifikaci, uznávání a evidenci uznaných zdrojů (§ 29 zákona č. 289/1995 Sb., o lesích, ve znění pozdějších předpisů). V současnosti je v klonovém archivu uchováváno 26 druhů lesních dřevin, např. dub letní, dub zimní, hrušeň polnička, jabloň lesní, jeřáb oskeruše, jeřáb ptačí, jeřáb sudetský, jilm habrolistý, jilm horský, jilm vaz, lípa srdčitá, lípa velkolistá, topol osika, třešeň ptačí, bříza trpasličí, lýkovec vonný, vrba dvoubarvá, smrk ztepilý, tis červený a další ohrožené nebo endemické druhy. Uchovávané klony jsou odvozeny především od těch druhů lesních dřevin, které představují cenné regionální populace nebo vykazují varující známky ústupu, anebo jsou přímo ohroženy abiotickými a antropogenními poškozujícími faktory. Růst, vývoj a životaschopnost výpěstků in vitro jsou dlouhodobě ověřovány na testovacích plochách. Pro výsadbu jsou použity pouze výpěstky, které odpovídají standardům kvality sadebního materiálu. Výpěstky in vitro musí splňovat kriteria požadovaná pro sadební materiál uvedená v ČSN 82115, v zákoně 149/2003 Sb. (zákon o uvádění do oběhu reprodukčního materiálu lesních dřevin) a ve vyhláškách č. 29/2004 Sb. a č. 139/2004 Sb., ve znění pozdějších předpisů.

Mikropropagační postupy jsou standardizovány i pro jiné ohrožené druhy rostlin jako je hořec jarní, koniklec jarní, zvonovec liliolistý nebo sinokvět chrpovitý. Realizace záchranného programu probíhá ve spolupráci s Agenturou ochrany přírody a krajiny ČR.

Růst výpěstků in vitro je také dlouhodobě sledován na 15 demonstračních objektech, pravidelně se hodnotí rychlost růstu, morfologie a vitalita. Demonstrační objekty byly zřízeny pro hodnocení výpěstků in vitro smrku ztepilého, douglasky tisolisté, lípy malolisté, dubu letního, buku lesního, jilmu vazu a jilmu horského, jeřábu oskeruše, břeku a jeřábu ptačího, třešně ptačí a hybridní osiky. Nejstarší výsadby jsou na lokalitě u obce Kluky (Lesy Města Písku) a na Českomoravské vysočině na lokalitě Březina, která spadá do polesí lesního družstva Polná. Plochy byly vysázeny v roce 1998 a společně s výpěstky in vitro byly vysázeny i generativní sazenice příslušných druhů. Biometrická měření přírůstů a celkový morfologický vývoj ukazují, že výpěstky in vitro se vyvíjejí srovnatelně se semenáčky, a ani jejich mortalita není vyšší.

Závěrem

Moderní biotechnologické postupy (zahrnující mikropropagace a genetické inženýrství) představují v současnosti nové alternativy ve šlechtění lesních dřevin. Aplikace biotechnologií v lesnictví je prioritou při plnění programů na ochranu biodiverzity přijatých vládou ČR. Odpovídá to Sdělení Ministerstva zahraničních věcí č. 134/1999 Sb., kterým byla přijata Úmluva o biologické rozmanitosti ze dne 5. 6. 1993 v Rio de Janeiru a rezolucím Ministerských konferencí o ochraně lesů v Evropě (Štrasburk 1990, Helsinky 1993, Lisabon 1998, Vídeň 2003, Varšava 2007) a zároveň je to v souladu se stále rostoucím světovým trendem využívat biotechnologické postupy ve šlechtění.

Autoři:

RNDr. Jana Malá, CSc.

Výzkumný ústav lesního hospodářství a myslivosti, v.v.i.

E-mail: Tato e-mailová adresa je chráněna před spamboty. Pro její zobrazení musíte mít povolen Javascript.

Ing. Pavlína Máchová, PhD.

Ing. Helena Cvrčková, PhD.

RNDr. Petr Šíma, CSc.